Símbolo de la Verdad revelada, la Disputa del Sacramento se podría llamar mejor el Triunfo de la Iglesia o de la Fe. Efectivamente, Rafael ilustra allí la Verdad suprema: Dios, contemplado en el cielo en la visión beatífica y adorado por la Fe en la tierra, bajo la especie de la Hostia consagrada. Dedicada al misterio sorprendente y admirable del Verbo Encarnado.
Si en La Escuela de Atenas el hombre trata de entender sensatamente las razones de las cosas, porque este es su deber. En la Disputa del Santísimo Sacramento practica el libre albedrío aceptando la Revelación que abre el camino a la Salvación. La Teología, la figura femenina alegórica que domina la escena, recita, en latino la sentencia «divinarum rerum notitia».
Es importante la diferencia epigráfica. Los conocimientos humanos son alcanzables por la inteligencia humana y lógicamente comprensibles porque estos son «cognitio» (como está escrito encima del cuadro la Escuela de Atenas). Los Verdaderos supremos de la Religión son en cambio «notitia». Dios los revela. En cierto modo nos los ‘notifica’. Es el hombre que los acepta o los rechaza, siendo la libertad su principal derecho y privilegio.
El centro de la composición –formal y conceptualmente– es el ostensorio colocado en el centro del altar con la hostia sagrada, el Pan Eucarístico, hacia el cual convergen todas las líneas de la perspectiva. La Eucaristía —don de amor del cielo a la tierra y también una invitación a remitirse a la Trinidad— está situada sobre un eje ideal que une la Hostia al misterio trinitario. En torno a este eje central se reúne en contemplación toda la Iglesia, Triunfante y Militante, ordenada en dos hemiciclos concéntricos sobrepuestos. Las tres Personas de la Santísima Trinidad se hallan en línea con la hostia eucarística y claramente la representan; en alto el Eterno Padre bendiciendo, en el centro Cristo entre la Virgen y San Juan Bautista, todos los santos, los patriarcas, los profetas de la Iglesia Triunfante, están ubicados en semicírculo, debajo la paloma del Espíritu Santo que irradia el ostensorio. Las tropas celestiales descansan sobre blandas nubes de ángeles. La maravillosa cortina en oro que se halla detrás del Omnipotente es engalanada con ángeles que se balancean.
El Eterno Padre da la bendición; debajo, en una gran aureola, el Hijo Humanizado, la Virgen en actitud de adoración y el Bautista; más abajo, el Espíritu Santo, inspirador de los cuatro Evangelios que están abiertos. A ambos lados del grupo central, los bienaventurados del Viejo y el Nuevo Testamento, sentados sobre las nubes, significan la Iglesia Triunfante. A la izquierda, San Pedro, Adán, San Juan Evangelista, David, San Lorenzo y un Profeta; a la derecha, Judas Macabeo (?), San Esteban, Moisés, Santiago el Menor, Abraham, San Pablo. Cada uno lleva signos que lo dejan reconocer.
En la zona inferior del fresco, los Padres de la Iglesia y los teólogos, que representan a la Iglesia Militante, discuten sobre la esencia del misterio. Alrededor del altar están los doctores de la Iglesia: Ambrosio y Agustín, Jerónimo y Gregorio sentados en los tronos, los demás están de pie o en posiciones diversas. Gracias a Vasari, que describió ampliamente los frescos de las Estancias, si bien es cierto que con muchas imprecisiones, disponemos de una primera identificación de los personajes: «He aquí a Domingo, Francisco, Tomás de Aquino, Buenaventura, Scoto, Niccoló de Lira, Dante (llamado teólogo en su época), fray Gerolamo Savonarola da Ferrara y todos los teólogos cristianos, e infinitos retratos copiados del natural».
La Disputa aún tiene alusiones a la puesta en escena del siglo XV, con alguna nostalgia de los estilos de Perugino y de la minuciosa belleza florentina de Fra Bartolomeo y de Marlotto Albertinelli).
Desde siempre este fresco lleva el nombre de Disputa del Santísimo Sacramento. El origen del título, completamente inadecuado, es de Giorgio Vasari el cual escribió, en sus Vidas, sobre personajes «disputantes» Sin duda alguna los santos y los doctores no discuten, más bien veneran, sorprenden, se emocionan de frente al vertiginoso misterio, buscan respuestas al extraordinario prodigio en sus libros. La mente humana se pierde, prueba consternación e infinita contrariedad frente a la Verdad revelada. Por suerte, nos ayuda, la misericordiosa presencia de Dios que manda su ángel para protegernos y para confortarnos. El agraciado joven rubio que está al borde del presbiterio, donde están reunidos los teólogos, hace mención de esto y nos invita con cordial gentileza a la devoción eucarística.