En esta escena también de arquitectura contemporánea y abovedada, aparece ilustrado el punto culminante del milagro que en el año 1263 tuvo lugar en Bolsena, localidad cercana a Orvieto, cuando un sacerdote bohemio, de peregrinación hacia Roma, experimenta terribles dudas acerca de la transustanciación. Después de rogar a la Providencia para que sus dudas se desvanecieran, mientras celebraba la Santa Misa, la Sagrada Forma comenzó a sangrar y teñir el corporal que cubría el cáliz. Para conmemorar dicho milagro, el papa Urbano IV (1261-1264) instituyó la fiesta de Corpus, cuyo oficio compuso Santo Tomás de Aquino. La reliquia del corporal sagrado se venera desde entonces en el Duomo de Orvieto. Detrás del oficiante, los fieles y los monaguillos son testigos del Milagro de Bolsena. Julio II también está presente. Domina, junto con su séquito, la mitad derecha del fresco.
La composición, que Rafael logró después de trabajar en varias alternativas, se desarrolla sobre una superficie de pared desafortunadamente cortada y cuya ventana, por culpa del tiro de una chimenea en el interior de la pared, está desplazada hacia la izquierda. El punto culminante de la misa está caracterizado por las velas de los monaguillos y por los sacerdotes oficiantes y el Papa, que están con la cabeza descubierta. El milagro de la Santa Misa es, en todos los tiempos, siempre el mismo. Por ello, también en este fresco, pasando los siglos por alto, pueden aparecer Julio II y el sacerdote alemán representados a la vez juntos, y el papa arrodillado tampoco es ni un anacronismo, ni hay por qué considerar que se trate de Urbano IV -el papa que instituyó en recuerdo del milagro de Bolsena la fiesta de Corpus Christi y que trasladó el corporal de Bolsena como la máxima reliquia a la catedral de Orvieto -con los rasgos de Julio II.
Rafael concibe la composición en el interior de una basílica, al modo de la Escuela de Atenas. Como hemos dicho, el descentramiento de la ventana respecto al arco de la pared le obliga a disponer con gran habilidad el tema central en la parte alta del dintel de la misma, en donde sitúa a la izquierda el altar con el sacerdote oficiando la misa. A ambos lados coloca unas escalinatas que resuelven el desnivel, con lo que logra magnificar el milagro 
que sucede en lo alto. Rafael coloca a Julio II a la derecha del altar. Detrás de él, se ven el cardenal Sangiorgio y el anciano cardenal Riario, que pocos años después estará implicado en una conspiración contra León X y será encarcelado en el Castillo de Sant’Ángelo. Rafael logra efectos de una pureza extraordinaria en la utilización de los colores.
Julio II es representado, junto al altar, frente al oficiante, arrodillado de perfil, a la derecha, en una actitud solemne y piadosa. Su poderosa figura lleva la barba blanca con la que regresó de Bolonia. Rafael lo retrata aquí con energía y firmeza, que contrasta con el profundo abatimiento del Retrato que le hará, en esta misma época, y en el que se observa el repentino empeoramiento de su salud. El episodio histórico aparece situado a la izquierda, donde una movida y gesticulante multitud se agolpa para contemplar el acontecimiento milagroso. Exhibición de movimiento que contrasta con las actidudes reposadas y estáticas del séquito papal que se distribuye a la derecha. Rafael resuelve de un modo extraordinario la conexión espacio-temporal del episodio histórico con el presente, señalando el tránsito de uno a otro como una sucesión de un momento agitado a otro de reposo; de la excitación del pasado a la quietud y seguridad del momento actual. Esta diferencia también es marcada en los caracteres de los personajes representados. Así, mientras los de la izquierda aparecen idealizados (similares a los de la estancia anterior), los de la derecha son presentados como vivos retratos sacados del natural.
Para apoyar este mensaje pictórico son imprescindibles los retratos contemporáneos de sus acompañantes y la suntuosa, actual vestimenta de tejidos opalescentes. Rafael ofrece a los ojos las ricas telas con tal precisión que es posible reconocerlas exactamente y lo hace con pinceladas en parte anchas y de increíble ligereza y con aparente espontaneidad en la aplicación del color; la calidad y maestría de esta pintura se ha comparado a menudo, con paralelos venecianos. La intensidad de los numerosos retratos fruto de agudas observaciones se ve subrayada por el contraste con esta forma ligera de pintar lo ropajes. Es importante destacar cómo desde la pintura, el soldado de la guardia suiza, un coetáneo de Julio II, Rafael -en la parte inferior derecha del fresco-, y un niño coetáneo del sacerdote alemán -en la parte inferior izquierda de la pintura, buscan el contacto visual con el espectador, con lo que éste queda incluido en los acontecimientos del fresco. Estos suizos arrodillados a la derecha y en primer plano son extraordinarios, más que los retratos de los cardenales que están detrás del papa. Ocupan la escena con Indiscutible autoridad. En aquellos años en Italia, nadie habría sido capaz de expresar en un retrato varonil, una precisión fisonómica y espiritual y al mismo tiempo una constancia de la representación comparables a las que Rafael manifiesta aquí con divina desenvoltura y sencillez.
El grupo de la guardia suiza, con su peculiar vestimenta diseñada por Miguel Ángel, es, de por sí, una obra maestra. Rafael muestra en él una nueva técnica de iluminación y modelado plástico, que desarrollará ampliamente en otras obras posteriores. Se mantiene fiel a la expresión de los caracteres psicológicos de las «pasiones» o «movimientos del alma», recomendados por Leonardo y Alberti en sus tratados. Las figuras componen una estructura piramidal, cuya base la constituyen, por una parte el grupo de mujeres y niños sentados, y por otra, el grupo de guardias suizos arrodillados. Las miradas del niño de la izquierda y del suizo de la derecha establecen puntos de contacto con el mundo del espectador.
